感染及脓毒症是儿童重症监护室(PICU)急危重症患儿的主要死亡原因。近年来新型病原微生物、耐药病原微生物的增多，以及危重症患儿免疫抑制状态，导致PICU严重感染患儿病死率居高不下。脓毒症作为严重感染的主要病症，最新中国脓毒症相关性标化病死率为66.7例/10万人口，全国每年共有脓毒症相关性死亡病例近万例，高于发达国家；最新全球儿童脓毒症及脓毒症休克统计数据显示，发展中国家加权病死率为31.7%，高于发达国家的19.3%。重症感染通常起病急、进展快、累及多个器官、病原体复杂多样，如何尽早明确致病病原体对临床治疗决策制定至关重要。
1 重症感染
精准化病原学检测的意义
生物标记物的开发为早期、精准明确致病微生物提供了新的鉴别手段。生物标记物是指能够目标性检测用于评估或区分正常生理或病理过程，或者能够反映药物治疗干预效果的一类化合物。生物标记物分为诊断标记物和预后评估标记物。其中白细胞计数(WBC)、C-反应蛋白(CRP)、降钙素原(PCT)和白细胞介素(IL)-6等传统炎症标记物已广泛应用于临床。但传统炎症标记物无法区分脓毒症与全身炎症反应综合征，无法区别具体病原。
分子生物学、微流控检测技术、宏基因组学、代谢组学、转录组学及微生物组学等技术的发展，以及现代医学对感染与宿主互作机制的深入认识，感染病原学不断聚焦于快速、精准的诊断。
2 常规炎症标记物
与病原学鉴别诊断
天然免疫细胞表达Toll样受体(TLRs)或核苷酸结合寡聚化结构域NOD样受体(NLRs)识别入侵各种病原微生物，释放肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β和IL-6等促炎因子；这些促炎因子促进急性期蛋白释放(如CRP、PCT等)。CRP主要由肝脏合成，感染4～6h后即明显释放，36～48h达到顶峰，其血液中的半衰期大约为19h；与革兰阳性(G＋)细菌的磷壁酸结合，与革兰阴性(G－)细菌的脂多糖结合。CRP显著升高可作为细菌性脓毒症早期的炎症标记物，CRP测定对于疗效判断具有较好的预测价值，但特异性不高，病毒、真菌等感染也可以升高或轻度升高。
PCT是过去10年间研究最多的与感染相关的炎症标记物。细菌感染时在内毒素、促炎因子(IL-1β，TNF-α和IL-6)刺激下，PCT水平升高；而在病毒感染时，干扰素γ的增加会抑制PCT的合成和释放。健康人体内PCT水平极低(0.1μg/L)，仅限于甲状腺神经内分泌C细胞分泌；而在感染时，PCT几乎可以从所有组织细胞中释放，感染3～6h内PCT水平开始增加，12～24h达到峰值，PCT的半衰期为24h。感染消除后，PCT水平每天降低50%。PCT与CRP相比，PCT水平不受中性粒细胞缺乏或者免疫抑制剂干扰。因此，PCT是预测脓毒症更可靠的指标。G－细菌感染的脓毒症患者PCT浓度(5.0μg/L)明显高于G＋细菌感染(2.0μg/L)和(或)真菌感染患者(2.1μg/L)。支原体肺炎中PCT较低，而CRP在两者中均升高。CRP/PCT比值升高与支原体肺炎密切相关[OR15.04(5.23～43.26)]，ROC面积达到0.91，可以用来区分肺炎支原体还是肺炎链球菌。在住院社区获得性肺炎(CAP)中，CRP/PCT比值增加常常提示肺炎支原体感染。
呼吸机相关性肺炎(VAP)是重症监护室常见并发症，早期识别并预警VAP对于缩短患儿住院时间，降低病死率具有意义。TNF-α和CRP等常规炎症指标无法鉴别VAP病原；但最近有研究发现：绿脓杆菌作为多重耐药G－致病菌是VAP主要致病菌之一，可以通过IKK/NF-κB信号通路促进TNF-α升高，肺部表达TNF-α、IL-1β、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白2(macrophageinflammatoryprotein-2，MIP-2)，提示TNF-α、IL-1β、IL-6可作为警惕绿脓杆菌诱发VAP发生的炎症标记物；也有研究发现患者TNF-α、IL-1β和IL-10基因的单核苷酸多态性(SNP)与患者感染易感性和预后有关；与特定病原的致病敏感性关联尚无报道。
3 新型炎症标记物的应用
3.1 新型炎性反应蛋白
除CRP和PCT之外，机体产生其他急性期蛋白(APP)对致病微生物的病原学诊断也具有辅助诊断意义。这些APP主要包括Pentraxins(PTX)、五羟色胺和血清淀粉样蛋白(SAA、SAP)等。细菌感染和病毒感染均会引起PTX、CRP和SAP表达增加，APP水平可反映抗病毒治疗和疫苗的疗效，且APP能降低多种病毒的感染能力。炎性因子刺激下，各类免疫细胞、内皮细胞和上皮细胞均分泌PTX3，在严重脓毒症或脓毒性休克发生后6～8h可见PTX3水平显著升高(μg/L)，而健康者体内PTX3水平几乎检测不到(2μg/L)；金黄色葡萄球菌、有氧假单胞菌、肺炎克雷伯菌、大肠杆菌、曲霉和甲型流感病毒均会引起PTX3水平增加，但IL-6和干扰素刺激条件下，不会分泌PTX3；PTX3可能具有鉴别细菌和病毒感染的潜在能力。Presepsin(PSP)是新近发现的早期识别细菌感染的APP。整体上，APP对感染病原学鉴别诊断的临床意义值得开发。
3.2 血液特异RNA
高通量组学技术能够通过血液分析获取多种生物标记物的变化，用于感染病原的鉴别诊断。Suarez等检测成人患者血液样本，发现干扰素相关基因(IFI44、IFIT3、IFI27、RSAD2、OAS2、OASL、IFIT2和PARP9)能鉴别细菌和病毒性感染，该组基因过表达量呈现出单纯病毒感染细菌混合感染单纯细菌感染的特点；鉴别病毒感染敏感性达95%(95%CI77%～%)，特异性92%(95%CI77%～98%)，比传统指标PCT鉴别诊断细菌和病毒感染具有优效性。外周血RNA生物标记物变化早于临床症状出现，耗时仅1.5h左右，具有快速便捷性。针对儿童细菌与病毒感染的鉴别，Mahajan等报道对60日龄以下发热婴儿细菌感染的机体血样中RNA生物特征，10个基因(BATF、MSRA、ALOX5AP、PADI4、RAB27A、FCAR、MGAM、HNRNPA3P1、MMP9、HSH2D)鉴别细菌和非细菌感染的敏感性和特异性均高于90%。有报道采用微分析法发现儿童感染患者血液中FAM89A和IFI44L转录RNA鉴别细菌敏感性为%(95%CI%～%)，特异性96.4%(95%CI89.3%～%)。一旦明确机体血样RNA生物特征表达谱的临床意义，其检测可通过分子生物学技术手段实现快速、准确分析，是未来感染病原学辅助诊断的重要手段。
细菌或病毒感染时，血液microRNA水平发生相应变化。DNA病毒如疱疹病毒和多瘤病毒，可以编码独特的病毒miRNAs，释放入血，成为特异性病毒特异性诊断标记物；对于RNA病毒或逆转录病毒，细胞内部表达的miRNAs的分析可能为识别病毒或对疾病阶段进行分类带来新的方法；外周血单核细胞(PBMCs)、血浆或外泌体均可作为miRNAs的检测样本，是一种无创、微量、快速、敏感的感染病原诊断手段。然而，不同个体中特异性miRNAs需要进一步探索。
3.3 代谢小分子与病原学诊断
花生四烯酸代谢产生的脂氧素类(Lipoxins)、ε-3脂肪酸衍生的消退素(Resolvins)、胞壁质(Maresins)、前列腺素(Prostaglandins)被统称为脂质介质(lipidmediator)，通过与同源受体(G蛋白耦联受体超家族成员)结合而发挥其生物学效应，在维持免疫炎性反应稳态方面发挥着关键作用。Resolvins家族分子是一类具有抗炎效能的脂质介质。ResolvinD2(RvD2)由内源性ε-3必需脂肪酸产生，通过调节一氧化氮合成、降低白细胞黏附受体表达来影响白细胞和内皮细胞相互作用，减少过量炎症因子产生。临床研究提示血清RvE1水平与CRP成正相关，随炎症缓解，其水平降低；且RvD1是机体阻断早期炎性反应，避免进展为慢性炎症的关键分子。脂质介质作为内源性抗炎/促分解脂质介质可加速炎症的消退，与炎性反应平行并存，是一类重要的炎症标记物。
甲型流感病毒(IAV)引起呼吸道感染，动物模型中肺、脾、血浆和支气管肺泡灌洗液中发现，12-羟基二十碳三烯酸(12-HETE)、15-HETE、17-羟基二十二碳六烯酸(17-HDHAs)与IAV感染密切相关，是IAV感染鉴定的潜在炎症标记物。I型干扰素(IFN)抵抗病毒感染，与IL-1家族细胞因子的产生和炎症小体活性之间存在负反馈调节；巨噬细胞内IFN诱导的胆固醇25-羟化酶(cholesterol25-hydroxylase，Ch25h)促进氧化胆固醇25-羟基胆固醇(oxysterol25-hydroxycholesterol，25-HC)合成，进而抑制IL-1转录及IL-1活化炎性小体。病毒或细菌感染引发的代谢组学图谱的变化，与病毒、细菌感染的病原学诊断的指导意义，临床样本中该类炎症标记物的检测均有待开发。
3.4 免疫细胞标记物
有研究发现中性粒细胞表达CD64是诊断细菌感染的非常有意义的生物标记物。最近一项儿科重症前瞻性双盲观察结果显示：PICU入院时中性粒细胞(nCD64)与PCT和CRP呈正相关，nCD64区分细菌和病毒感染的ROC曲线下面积为0.83，可能是病原学诊断的新型标记物。我们前期研究发现，血清可溶性CD水平和单核细胞表面表达CD可鉴别脓毒症相关噬血细胞综合征的发生。EB病毒是感染继发噬血细胞综合征的主要致病微生物，血清可溶性CD可能在噬血细胞综合征感染病原诊断中提供辅助诊断依据。
4 展望
重症患儿精准化诊断及个体化治疗策略是重症医学的发展方向。联合分子生物学、转录组学、宏基因组以及代谢组学等方法使病原学精准诊断成为可能。传统炎症因子、急性期蛋白、血液RNA生物特征谱、代谢小分子以及免疫细胞标记物有助于从多个角度实现对病原微生物的多维鉴别诊断，这一领域的长足发展必将为重症的个体化精准治疗带来临床受益。
本文编辑：林楠
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